以Ig或TCR基因重排为PCR靶目标检测MRD
叶向军卢兴国
对大部分ALL和非霍奇金淋巴瘤、部分CLL/SLL和浆细胞骨髓瘤患者，采用当前的细胞毒性治疗方案可以诱导完全缓解。治疗方案中异体和自体干细胞移植（stemcelltransplantation，SCT）的引入，进一步增加了这些病例的缓解率。然而，这些治疗方案似乎不能杀死克隆源性恶性细胞，许多患者即使细胞形态学达到完全缓解，最终仍会复发。细胞形态学技术的检出限为不低于1%~5％的恶性细胞，这意味着这些技术提供治疗效果的信息有限。在过去的20年里，开发了用于检测治疗期间和治疗后更低恶性细胞比例和更敏感的技术。MRD检测技术至少应达到10-3（恶性细胞/每千个正常细胞）的敏感性，敏感性最好在10-4~10-6之间。这种敏感性可检测到真正的MRD，可以评估总体治疗的有效性和各治疗阶段的作用。
检测MRD技术用于细胞毒药物治疗和（或）SCT后治愈肿瘤患者尤其有价值。这些肿瘤包括ALL，几种类型的非霍奇金淋巴瘤以及浆细胞骨髓瘤。MRD检测的信息可以用于指导治疗和SCT。
一、连接区作为PCR靶目标的MRD检测
重排的Ig和TCR基因连接区具有独特的指纹样序列，假定为每个淋巴细胞都是不同的，则各个淋系肿瘤也不同。因此，连接区可作为MRD-PCR分析的肿瘤特异性靶目标。
MRD-PCR检查，在诊断时，必须使用各种PCR异源双链分析或基因扫描分析鉴定各种Ig和（或）TCR基因重排（图13-6）。随后，确定连接区精确的碱基序列，该序列信息，可用来设计连接区特异性寡核苷酸。在患者随访中，这些寡核苷酸可以用于两种不同恶性细胞的检测。一种是将寡核苷酸作为杂交试验中针对患者特异性连接区探针来检测恶性细胞的PCR产物。另一种是将连接区特异性寡核苷酸作为PCR引物，用来扩增恶性克隆特异性的重排。
二、连接区PCR分析的灵敏度
理论上，连接区MRD-PCR分析的检测限最大可达10-6。依据是，一个反应管中可检测1百万个细胞（相当于约6.5μg的DNA），但是通常每管只有ng~1μg的DNA。连接区MRD-PCR分析的灵敏度还取决于重排的类型，连接区的大小，以及可以比较的Ig或TCR基因重排的正常淋巴细胞背景。完整的V-D-J重排的连接区较广，而V-J重排的连接区小3~4倍。
正常细胞可以包含与白血病细胞相同的重排基因片段。例如，在T-ALL中经常发生的Vδ1-Jδ1重排，也见于一小部分正常血液T细胞（0.1%~2％）；VγI-Jγ1.3和VγI-Jγ2.3重排发生在许多T细胞肿瘤，也见于相当高比例（70%~90％）的正常血液T细胞。这可能会显著影响灵敏度水平，特别是考虑到在诱导后随访标本中，正常T细胞有丰富的多克隆Vγ-Jγ连接。因此，外周血样本中长的Vδ1-Jδ1连接区MRD-PCR分析（10-4~10-5）通常比短的Vγ-Jγ连接区MRD-PCR分析（10-3-10-4）更敏感。同样，在治疗期间和之后的再生骨髓中，具有多克隆IGH基因重排的正常前体B细胞的大量扩张，可能会影响使用Ig基因重排作为PCR目标的MRD检测的灵敏度。
三、实时定量PCR分析Ig或TCR基因重排连接区检测MRD水平
将Ig或TCR基因重排的连接区作为分子目标检测MRD，是用实时定量PCR（real-timequantitativepolymerasechainreaction，RQ-PCR）技术进行的，它能在指数扩增期准确定量。最广泛使用的RQ-PCR技术定量检测MRD采用TaqMan探针技术。该方法利用5→3核酸酶活性的Taq聚合酶检测和定量，并随着反应进行生成特定的PCR产物。
随着扩增的进行，内部的目标特异性TaqMan探针（水解探针）将报告基团与共轭的淬灭基团分离，连续的PCR循环过程中积累的报告基团发出荧光信号。由于是实时检测，该方法有一个非常大（超过5个数量级）的动态检测范围，从而避免后续标本连续稀释的需要。由于无需PCR后处理，定量数据可以在很短的时间内完成。在每次测试中，产生一个实时扩增曲线（图8）。当循环的荧光信号超过一定的背景荧光水平时，称为阈值循环（thresholdcycle，CT），它直接与标本中存在的目标DNA量成正比。使用这些方法可将诊断标本连续稀释，而且在治疗期间或之后，随访标本中的残留白血病细胞数量可用诊断样品的标准曲线来计算。
图8前体B-ALL中TCRD/A基因重排和RQ-PCR分析Vδ2-Jα基因重排检测MRD
a为在TCRD/A基因座涉及Vδ2基因片段的连续重排，是前体B-ALL的特征。主要途径包括连续的Vδ2-Dδ3→Vδ2-Dδ3-Jα重排。Dδ2-Dδ3和Dδ2-Jα基因重排也可发生，但频率要低得多。基因片段下方的实心方框代表用于Southern印迹杂交的探针。b为RQ-PCR分析Vδ2-(Dδ3)-Jα基因重排示意图。位置和序列给出的是胚系Vδ2TaqMan探针、胚系Vδ2正向引物以及４种最常用的Jα基因片段的反向引物。c为在前体B-ALL中，DNA稀释成单个核细胞DNA的实时扩增曲线的系列诊断。采用TaqMan探针技术的RQ-PCR分析，是通过使用Vδ2-Jα56基因重排与连接区特异性引物的方法来实现的。在这种情况下，可重复敏感度达到了10-5当前用RQ-PCR方法，可使MRD-PCR目标的定量范围达到10-4。待检样本经系列稀释后，RQ-PCR的定量范围应符合下列条件：①对初诊病例的同一份标本应至少重复实验2次，追踪病例的同一份标本应至少重复3次，各重复样本之间的CT值差异应小于1.5；②最低稀释样本检测所得CT值均应小于背景水平CT值的3.0以上；③所有稀释样本重复实验所得的平均CT值，应与该样本10倍稀释后所得的CT值相差2.6~4.0，与2倍稀释后所得的CT值相差0.5~1.5。
四、急性淋巴细胞白血病中连接区MRD-PCR分析
1.前体急性淋巴细胞白血病Ig和TCR基因重排
几乎所有的前体B-ALL病例（96％）有重排的IGH基因。在大多数病例（80%~90％）中，这些重排的IGH基因涉及至少一个等位基因上的完整的VH-DH-JH重排。在22％的患者中，可鉴定到不完整的DH-JH重排。大多数前体B-ALL包含IGK基因重排（30％）或缺失（50％）；20％的前体B-ALL病例有IGL基因重排。
在儿童期前体B-ALL中，出现高频率的跨系TCR基因重排：分别发现35％、60％和90％的病例有TCRB、TCRG和TCRD的基因重排和（或）缺失。在前体B-ALL中，跨系TCR基因重排的范围非常有限。TCRB基因重排限制在Jβ2区。这与正常的T细胞和T-ALL在Jβ1和Jβ2基因区都有发生的有所不同。在多数儿童期前体B-ALL（70％）中，TCRG基因重排常涉及Jγ1区基因片段的重排。值得注意的是，80％TCRD基因重排代表不完整的Vδ2-Dδ3或Dδ2-Dδ3连接。此外，Vδ2-Dδ3重排容易继续重排，特别是与Jα基因片段，伴随着出现Cδ外显子缺失（图13-7），以及随后的Vα-Jα重排。事实上，在儿童期前体B-ALL中40％的TCRD基因缺失大概由Vδ2-Jα重排导致，而剩下≤60％的Cδ缺失最可能由Vα-Jα重排引起。
总之，绝大多数（90％）的前体B-ALL患者可以运用IgH、IGK、TCRG、TCRB和（或）TCRD/A基因连接区的基因重排进行监测。
2.T-ALLTCR和Ig基因重排
根据TCR基因重排模式的主要差异，T-ALL可以再分类为CD3?、CRγδ+、TCRαβ+亚组。在全部T-ALL中TCR基因重排的频率非常高，约10％的CD3-T-ALL病例仍保留所有胚系构型的TCR基因；这主要涉及不成熟CD1-/CD3-T-ALL的前胸腺细胞性（prothymocytic）/前T-ALL亚组。在约80％CD3-T-ALL病例中有TCRD基因重排，在约10％病例中包含TCRD基因的双等位基因缺失。正如预期的那样，所有的TCRγδ+T-ALL有TCRG和TCRD的基因重排，而且绝大多数（约95％）还包含TCRB基因重排。
所有的TCRαβ+T-ALL病例含有TCRB和TCRG基因重排，而且由于TCRA重排导致至少有一个TCRD等位基因缺失；在三分之二病例中，第二个TCRD等位基因也缺失。在T-ALL中，跨系Ig基因重排发生的频率相对较低（约20％），几乎全部涉及IGH基因。异源双链PCR分析表明高频率（约80％）的不完全DH-JH重排。
总之，几乎所有的T-ALL病例（95％）中，TCRG、TCRB和（或）TCRD连接区是MRD监测的合适目标。
五、Ig和TCR基因重排的寡克隆及克隆演变
在前体B-ALL和T-ALL中，Ig和TCR基因重排可能会因为持续重排或者在这些不成熟的肿瘤性淋巴细胞活性重组酶系统介导下发生二次重排而易于形成亚克隆。尤其在诊断和复发的时间间隔之间，IGH基因重排发生改变。事实上，在30%~40％的前体B-ALL中，发现在诊断时已经有多重IGH基因重排，表现为出现双克隆或寡克隆。在诊断时，寡克隆中何者可能在复发时显露这一问题仍有不确定性，因此应用MRD-PCR方法监测。大多数持续或继发的IGH基因重排分别代表VH到DH-JH重排或VH替换。在这些重排期间，DH-JH连接区仍然未受影响，导致在相对稳定的DH-JH区周围的引物设计的概念，以防止假阴性的PCR结果。
在T-ALL中，诊断时很少见到TCR基因寡克隆。与此相反，结合Southern印迹和PCR数据表明，在交叉系列TCR基因重排的前体B-ALL中寡克隆频率约为20％，略少于IGH基因重排者。最初，根据Southern印迹结果显示，在诊断时TCRD基因复合体较少形成亚克隆。PCR异源双链分析和测序则显示，在新诊断的前体B-ALL病例中，Vδ2-Dδ3和Dδ2-Dδ3重排的寡克隆为30%~40％。
由于克隆演变而导致的假阴性是使用Ig或TCR基因重排作为PCR目标MRD检测的一个主要缺点。在儿童期前体B-ALL中，复发时Ig或TCR基因重排模式改变的发生频率高，尤其是在诊断时已经有亚克隆形成的情况下。儿童期前体B-ALL中的单克隆MRD-PCR目标的特点是稳定性高，复发时约可检测到所有目标的90％。与此相反，MRD-PCR的寡克隆目标在复发时只保留40％。目前，IGK-Kde基因重排被认为是MRD-PCR法检测最稳定的目标，可能是因为它们很少有寡克隆并且代表最终阶段的重排，不容许持续或再次重排。
尽管儿童期ALL复发时免疫遗传型改变的频率高，在75%~90％的前体B-ALL中至少有一个重排的IGH、TCRG和（或）TCRD等位基因仍然稳定，而T-ALL病例则达90％。更重要的是，在大部分ALL患者中至少有两个合适的PCR目标（检测对象）可用。因此，现在普遍认为MRD-PCR检查最好是每位患者至少采用两个Ig或TCR的检测目标。这种方法可使假阴性MRD结果大幅减少。
六、成熟B细胞肿瘤中PCR分析Ig基因
所有成熟的Ig阳性B细胞肿瘤包含IGH基因重排，其中大多数在两个等位基因上都有。Igκ+B细胞肿瘤包含一个重排IGK等位基因（约80％的病例）或两个重排的等位基因（约20％病例）。Igκ+B细胞肿瘤中，IGL基因重排罕见。Igλ+B细胞肿瘤含一个等位基因上（约75％）或两个等位基因上（约25％）的IGL基因重排，而且至少有一个缺失的IGK等位基因，一般为双等位基因的IGK基因缺失。
在成熟B细胞肿瘤中，Ig基因重排的多个部位可作为MRD检查的PCR目标。事实上，在40%~50％的B-CLL病例中，很容易地检测到Ig基因重排，且由于它们常不包含体细胞突变，可当作MRD-PCR法的检测目标。不过，在许多B细胞淋巴瘤中，尤其是滤泡和滤泡后B细胞淋巴瘤以及浆细胞骨髓瘤中，由于PCR引物无法适当退火，Ig基因体细胞突变可能导致假阴性结果。采用多个V和J的通用引物对，至少有一个引物对不会受体细胞突变的妨碍，可以部分地克服这一问题。此外，DH-JH重排以及涉及Kde的重排可能提供额外的MRD-PCR检测目标。在MRD-PCR检查中，90％的病例用这种涉及Ig基因座中所有可能重排的补充方法提供最佳的检测目标。
七、成熟T细胞肿瘤中PCR分析TCR基因
T-ALL/LBL为TdT阳性的胸腺来源的肿瘤，而成熟（胸腺后）T细胞肿瘤无TdT表达，并经常表达TCR分子。利用TdT可以鉴别原始淋巴细胞肿瘤与成熟T细胞肿瘤。大多数慢性T细胞白血病，如成人T细胞白血病/淋巴瘤、蕈样肉芽肿/Sézary综合征和T-PLL表达TCRαβ分子，而少数T-LGL白血病属于TCRγδ系或NK细胞系。此外，大多数T细胞淋巴瘤属于TCRαβ系，只发现小类别的TCRγδ+T细胞淋巴瘤，如肝脾T细胞淋巴瘤。
除了NK-LGL白血病之外，几乎所有成熟T系肿瘤均存在TCRG基因重排。事实上，NK-LGL白血病所有的Ig和TCR基因为胚系构型。Southern印迹分析还表明，所有属于TCRαβ系的肿瘤有TCRB基因重排，其中大部分有TCRD基因的双等位基因缺失。因此，在成熟T细胞肿瘤MRD检查中，一般可以使用重排的TCRG基因的连接区作为PCR的检测目标。TCRB基因也可作为MRD-PCR法的检测目标，但目前的Vβ和Jβ通用引物不太适合可靠检测所有Vβ和Jβ基因片段。可以使用多个Vβ家族引物与单个Cβ引物的组合通过RT-PCR分析TCRB基因转录本的方法确定TCRB基因重排。一旦通过测序确定所涉及的Vβ和Jβ基因片段以及连接区，合适的引物和患者特异性的连接区探针就可以用于DNA水平上的MRD-PCR检查。
与成熟B细胞肿瘤不同，成熟T细胞肿瘤中的TCR基因不受体细胞突变影响。因此，治疗过程中和治疗后的监测应该比较容易。
总之，检测Ig或TCR基因重排是淋系肿瘤诊断的重要组成。克隆性检测经常用于淋巴增生的恶性性质的确认，对于非霍奇金淋巴瘤的诊断检查尤为重要。涉及Ig或TCR基因位点的特异性易位的检测可以进一步提供有预后意义的信息。同样，在VH-JH重排中SHM的检测可以确定B-CLL预后相关的亚型。用Ig或TCR重排还作为特异性PCR目标检测MRD，也成为ALL和一些非霍奇金淋巴瘤监测疗效的一种常规方法。
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